常 　山 , 張雅萍 , 肖光夏 　　 ( 第三軍醫大學附屬西南醫院燒傷研究所 , 重慶 400038)

　　提 　要 : 目的 　觀察抗白色念珠菌雞蛋黃抗體 IgY 的穩定性與體外生物學效應。方法 　用水溶法從免疫雞蛋黃中提取抗白色念珠菌抗體 IgY,ELISA 法檢測抗體耐熱、耐酸、耐堿的穩定性 , 觀察 IgY 抑制白色念珠菌生長和抑制白色念珠菌粘附腸上皮細胞(IEC26)。結果 　 IgY 在巴氏消毒后活性為對照的 61 % , 在 pH 7 1 0 至 3 1 0 酸性環境中活性改變不顯著 , 在 pH 7 1 9 ,37 ℃作用 150 min活性仍為對照的 60 % 。 IgY 在 10 mg/ ml 時能明制白色念珠菌生長和對腸上皮細胞的粘附 , 明顯降低細胞上清二胺氧化酶(DAO) 釋放。結論 　雞蛋黃抗體 IgY 具有高度穩定性和良好的體外生物學效應。

　　關鍵詞 : 雞卵黃抗體 ;IgY; 白色念珠菌

　　中圖法分類號 : R392.1 　　　 文獻標識碼 : A

Stability and activities of immunoglobulin Y against Candida albicans IgY in vitro

CHANG Shan , ZHANG Ya 2 ping , XIAO Guang 2 xia (Institute of Burn Research , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)

　　 Abstract : Objective 　 To observe bio 2 activities and stability of egg immunoglobulin Y (IgY) against Candida albicans . Methods  IgYwaspurified with simple water dilution method (WD) from the eggs yolk of hens immunized with Candida albicans . The stabilities of IgY against acid ,alkali , and heat were measured with ELISA. The effects of IgYon the growth of the bacterium and on its adhesion to cultured intestinal cells(IEC 2

6) were studied. Results 　 The minimal ELISA positive titer of IgYwas 1 ∶ 12 800 and 61 % activity remained after pasteurization. The decrease of IgYactivity was not apparent at pH value from 7 1 0 to 3 1 0 , and 60 % activity remained after 150 min incubation at pH 7 1 9 and 37 ℃ . IgY at 10mg/ ml inhibited the growth of Candida albicans apparently and prevented the adhesion of the bacterium (10 5 cfu/ ml) to cultured intestinal cells and the DAO production. Conclusion 　 Egg yolk IgYagainst Candida albicans possesses its activities against Candida albicans in vitro , and shows sta 2ble properties to heat and acid or alkali environments.

　　 Key words : egg yolk antibody; IgY; Candida albicans

　　免疫雞蛋黃中含有大量來源于血清的 IgG 抗體( 又名 IgY) , 濃度遠高于血清 , 且抗體提取簡單 , 來源十分豐富 , 近年來已引起了廣大研究人員的興趣。同時由于 IgY 的分子結構與哺乳類 IgG 的差異使 IgY 的穩定性遠高于哺乳類 IgG, 作檢測試劑時因不激活補體而比哺乳類 IgG 更精確。本研究用白色念珠菌作為抗原免疫產蛋雞 , 從蛋黃中提取出抗白色念珠菌 IgY,通過 ELISA 系統檢測其耐熱、耐酸、耐堿的穩定性 , 同時觀察了其抑制白色念珠菌生長和抑制白色念珠菌粘附培養腸上皮細胞的生物學效應 , 為口服應用奠定基礎。

1 　材料和方法

1.1 　抗白色念珠菌 IgY 抗體的制備

　　白色念珠菌 (CMCC 44104) 于 0 1 4 % 福爾馬林液中滅活后與等體積完全福氏佐劑混合乳化 , 作抗原皮下注射免疫 25 周齡Leghorn 雞 , 水溶法 ( 蛋黃溶于 9 倍蒸餾水 , 離心取上清并用硫酸鈉沉淀IgY)分離純化 IgY 并透析過濾除菌。紫外光雙波長測定 IgY 含量 ,SDS 2 PAGE 電泳檢測提取 IgY 的純度 , 細菌酶標染色觀察 IgY 結合白色念珠菌的特異性。

1.2 　 ELISA 檢測 IgY 的效價、耐熱、耐酸和耐堿穩定性

　　效價 : 將 IgY 從 1 ∶ 200 倍比稀釋至 1 ∶ 25 600 檢測其效價。耐熱 : 將提取 IgY 分別置于 25 、 37 、 50 、 64 、 70 、 75 、 80 ℃孵育 15min 后稀釋 5 000 倍進行 ELISA 檢測。耐酸 : 將 IgY 分別置于 pH值為 1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 酸性環境中 37 ℃孵育 1 h 后稀釋 5 000 倍進行 ELISA 檢測。耐堿 : 將 IgY 置于 pH 7 1 9 的液體環境中 37 ℃分別孵育 30 、 60 、 90 、 120 、 150 min 后稀釋 5 000 倍進行 ELISA 檢測。 ELISA 操作步驟 : 白色念珠菌包被 96 孔酶聯板后依次加入 : 處理后 IgY 稀釋液 ( 每組 6 孔) ;兔抗雞 IgY 二抗 ; 最后加入鄰苯二胺底物顯色 30 min , 并用一滴 2 mol/L 硫酸終止反應 , 于490 nm 比色 ( 洗滌液為 0. 05 % Tween 2 20 , PH 7 1 4 0 1 01 mol/LPBS, 陽性對照分別為未加熱、酸和堿處理的 IgY 稀釋液 , 陰性對照的一抗為未免疫雞蛋黃提取物 ) 。

1.3 　 IgY 的體外生物學效應

　　 IgY 抑制白色念珠菌生長 : 實驗分 2 組 : ①對照組 :3 1 9 × 10 5cfu/ ml 白色念珠菌液于 37 ℃恒溫箱中孵育 , 于 6 、 12 、 24 、 32 h ,取樣后活菌計數。② IgY 拮抗組 : 將白色念珠菌(31 9 × 10 5 cfu/ml)分別加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml , 于 6 、 12 、 24 、 32 h , 取樣后活菌計數。

　　 IgY 抑制白色念珠菌粘附培養腸上皮細胞(IEC2 6) : 將含白色念珠菌(5× 10 5 cfu/ ml) 的 DMEM 培養液和含同濃度白色念珠菌的 DMEM 培養液 ( 分別加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml 于 37 ℃孵育預處理 30 min) 加入長腸上皮細胞的 96 孔板、每時相點設6 平行孔。觀察時相點為 : 加入白色念珠菌后 30 、 60 、 90 、 120 、150 min 。檢測指標與方法 : ①粘附細菌數 : 將各個時相點的培養孔去除上清 ,10 mmol/L pH 7. 4 PBS 沖洗培養孔 6 次 ( 每次200 μ l/ 孔) ,然后加入 0 1 25 % 胰蛋白酶2 0 1 02 %EDTA 消化液 100μ l/ 孔消化約 2 min 后接種于沙氏平板培養 72 h 后活菌計數。②上清液二胺氧化酶 (DAO) : 0 1 2 mol/L pH 7 1 2 的 PB 液 1 1 5 ml+ 二甲基聯苯胺 50 μ l + 尸胺底物溶液 50 μ l + 樣本 250 μ l +辣根過氧化物酶 50 μ l 共計 1 1 9 ml 置于 37 ℃水浴 30 min 于 436nm 比色。檢測時相點為粘附后 60 min 。

1.4 　統計學處理

　　采用 t 檢驗。

2 　結 　果

2.1 　 IgY 特異性、含量和純度

　　抗白色念珠菌 IgY 對該菌染色陽性而對綠膿桿菌 , 葡萄球菌染色陰性。提取物 IgY 含量平均為 13 1 7 mg/ ml 蛋黃液。將SDS 2 PAGE 電泳凝膠掃描 , 檢測 180 × 10 3 帶 (IgY) 所占百分比 , 得出 IgY 純度高達 95 % 。

2.2 　 IgY 效價和穩定性

　　效價 :ELISA 檢測出蛋黃 IgY 效價為 1 ∶ 12 800 , 而血清 IgG效價為 1 ∶ 6 400 。耐熱 : 以溫度為橫軸 , 以吸光值為縱軸 , 各溫度處理后的吸光值形成一曲線 ( 陽性對照 D 490 值為 1 1 841) , 見圖1 。曲線表明在 25 ～ 64 ℃作用后 IgY 的活性下降緩慢 ,64 ℃作用 15 min 后活性為對照的 61 % 。 64 ℃以上作用 15 min 后 IgY活性迅速下降。耐酸 : 以 pH 值為橫軸 , 以吸光值為縱軸作一光滑曲線 ( 陽性對照 D 490 值為 0 1 827) , 取陰性對照 D 490 值 0 1 24 為縱軸原點 , 見圖 2 。曲線表明 IgY 在 pH 值為 3 以上時其活性改變不大 , 在 pH 值等于 3 時其活性為陽性對照的 70 % 以上 , 但在pH 值為 3 以下時其活性迅速下降。耐堿 : 以時間為橫軸 , 以吸光值為縱軸作一光滑曲線 , 取陰性對照 D 490 值 0 1 201 為縱軸原點 , 作用時間為 0 的 D 490 值為陽性對照 D 490 值 , 見圖 3 。曲線表明 IgY 在 37 ℃ pH 值 7 1 9 堿性環境中 , 其活性隨時間延長下降緩慢 , 在作用時間為 150 min 后其活性接近陽性對照的 60 % 。

2.3 　 IgY 的體外生物學效應

3 　討論

　　目前 IgY 已經引起廣大研究人員的興趣 , 它主要有三個特性 : ①產量大提取簡便 ②具有高度的穩定性和生物效應 ③作為診斷試劑干擾小。

　　本研究應用簡便水溶法提取 IgY 的產量高達 13 1 7mg/ ml 蛋黃液 , 純度高達 95 % ,ELISA 滴度在 1 ∶ 12 800 ,且 IgY 只對白色念珠菌染色陽性 , 對綠膿桿菌和葡萄球菌染色均陰性 , 表明 IgY 來源豐富、純化簡便、具有

較好的特異性 , 是一種具有很高研究和應用價值的抗體。

　　既往有學者采用抗體中和滴度法檢測 IgY 的穩定性 , 發現其具有良好的耐酸 , 耐熱的理化性質。本研究首次采用敏感的 ELISA 法對 IgY 的穩定性進行系統研究發現 IgY 具有高度的穩定性。 IgY 能耐受巴氏消毒(63

℃ 15 min) , 能耐受 37 ℃、 pH 值 3 以上的酸性環境1 h , 能耐受 37 ℃、 pH 7 1 9 堿性環境 150 min 。 37 ℃、 pH值 3 為通常狀況下胃環境 ,37 ℃、 pH 7 1 9 為通常狀況下腸道環境 . 因此上述結果表明 IgY 能夠通過食品工

業中常用的巴氏消毒法 , 口服后有望能在消化道保持高活性。這種穩定的理化性質對 IgY 作為口服藥物和診斷試劑都是十分有利和必要的。 IgY 優良的穩定性可能與其分子結構有關 : IgY 氨基酸及含糖量與哺乳類 IgG 有明顯差異 , 其分子結構雖仍然為 2H + 2L , 但它與哺乳類 IgG 最大區別是 IgG 的 Fc 段缺少 IgY 的第2 恒定區(C2 ) 而代之以 IgG 出現了一個鉸鏈區 (Hingeregion) , 而二者的抗原結合部位 F(ab) 尚未發現明顯不同。在某些雞蛋黃中天然含有 IgY 的 △ Fc 片段 , 而這種 △ Fc 片段比完整的 IgY 具有更高的穩定性。上述事實說明 IgY Fc 段結構變化對其活性有明顯影響。

　　本實驗中 IgY 體外能明顯抑制白色念珠菌生長 ,抑制強度和時間與濃度呈量效關系。篩選出的 IgY 濃度 (10 mg/ ml) 能明顯抑制細菌生長達 24 h , 而前 24 h正是該菌的對數生長期 , 表明 IgY 具有良好的抑菌效果。同時在該濃度下 IgY 在各時相點能明顯抑制白色念珠菌對培養腸上皮細胞的粘附 , 其抑制效果同樣具有量效關系。 IgY 抗體抑制白色念珠菌生長主要機制可能為抗體封閉白色念珠菌表面抗原 , 防止白色念珠菌向菌絲體轉變 ; 引起凝集等。同時白色念珠菌是典型的粘附致病菌 , 特別在腸道 , 白色念珠菌感染的首要條件是通過菌體表面抗原粘附在腸上皮細胞上 , 因而抗體封閉菌體表面抗原對防止白色念珠菌感染將起到重要作用。二胺氧化酶 (DAO) 是一種控制腸粘膜增殖的細胞質酶 , 主要存在于哺乳動物腸上皮細胞內。腸上皮細胞受損時 , 其細胞內 DAO 下降 , 而上清 DAO 明顯升高。因此 DAO 已成為反映腸上皮細胞因缺血和感染而受損的重要敏感指標。本實驗應用 IgY 處理白色念珠菌后 , 在粘附高峰明顯降低了腸上皮細胞 DAO的釋放 , 保護了細胞免受白色念珠菌的破壞。 IgY 抑制白色念珠菌生長、抑制其粘附腸上皮細胞的結果表明該抗體不僅具有良好的穩定性和特異性 , 還具有高

度的生物學活性和高度結合抗原的能力。

　　目前已成功提取出抗蛋白質、病毒、細菌的 IgY,并發現其具有良好的抗病毒抗細菌的生物學效應 , 用于口服防治腸道病原體已取得良好效果。本研究制備出抗白色念珠菌 IgY, 發現該抗體產量高 , 穩定性極好 , 具有很好的生物學效應 , 作為口服藥物或食品添加劑預防和治療病原性腹瀉和腸源性感染將具有廣闊的前景。

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( 編輯 　陳聰連 ）